ISBN 9783843901550

978-3-8439-0155-0, Reihe Biologie

Susanne H. Meyer
Tth-IM60 eine Membraninsertase aus Thermus thermophilus

177 Seiten, Dissertation Universität Hohenheim Stuttgart-Hohenheim (2011), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Die Proteine der evolutionär konservierten YidC/Oxa1/Alb3-Familie sind an der Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein Tth-IM60 aus Thermus thermophilus als Mitglied dieser Familie identifiziert, sowie funktionell und strukturell näher charakterisiert.

So konnte mit Komplementationsstudien, die in vivo mit einem Escherichia coli YidC- Depletionsstamm durchgeführt wurden, gezeigt werden, dass Tth-IM60 das YidC Protein funktionell ersetzen kann. Außerdem konnte Tth-IM60 heterolog in E. coli C43 Zellen im pMS-Vektor mit einem C-terminalen His-tag exprimiert werden. Bei der Solubilisierung zeigte sich, dass das Protein in der Zelle vermutlich als Dimer vorliegt, allerdings nach der Reinigung dazu tendiert in einen höheren Oligomerzustand überzugehen, der nicht spezifiziert werden konnte. In diesem Zustand ist das Protein jedoch für mindestens 50 Tage sehr stabil. Mit Hilfe von Größenausschlusschromatographien konnten das zwitterionische Detergenz LDAO und der Puffer aus 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl und 10 % Glyzerin als optimal für die Stabilität und Reinigung identifiziert werden. In diesem Puffer gelang es, das Protein über zwei Affinitäts- und eine Gelfiltrationschromatographie als Dimer zu reinigen und eine Konzentration von 10 mg/ml Protein als Voraussetzung für projektierte Kristallisationsversuche zu erreichen.