ISBN 9783843943642

978-3-8439-4364-2, Reihe Biotechnologie

Yujun Zhang
Engineering of phosphoserine aminotransferase and new metabolic pathways for microbial production of 1,3-propanediol and 1,2,4-butanetriol from sugar

147 Seiten, Dissertation Technische Universität Hamburg (2020), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

In dieser Arbeit wurde eine Phosphoserineaminotransferase (SerC) aus E. coli untersucht und so modifiziert, dass die notwendige Deaminierung von L-Homoserin erzielt wird. Um die Substratspezifität von SerC von L-Phosphoserin zu L-Homoserin zu ändern, wurde eine rationale computergestützte Methode angewandt. Nach insgesamt drei screeningdurchgängen wurden die vielversprechendsten Kandidaten ausgewählt und experimentell verifiziert. Die spezifische Aktivität bezüglich L-Homoserin der am besten geeigneten Mutante, SerC(R42W-R77W), wurde um das 4,2-fache verbessert im Vergleich zum Wildtyp, wobei die spezifische Aktivität von L-Phosphoserin um das 43-fache gesenkt wurde. Neben der ortsgerichteten Mutagenese wurden auch die zufällige Mutagenese und die semi-rationale Design Methode angewandt, um eine größere und diversere Mutantenbibliothek zu generieren. Im Anschluss wurden drei verschiedene Strategien benutzt, um die Mutantenbibliothek zu screenen. Schlussendlich wurde eine verbesserte SerC Mutante identifiziert (R42W-R77W-R329P). Diese Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp eine 5.5-fach erhöhte Aktivität bezüglich L-Homoserin und keine Aktivität gegenüber L-Phosphoserin. 1,2,4-Butantriol (BT) ist am bekanntesten als Ausgangsstoff für die Herstellung von 1,2,4-Butantrioltrinitrat (BTTN), was als Treibstoff und Weichmacher verwendet wird. Der neue Stoffwechselweg umfasst fünf konsekutive enzymatische Reaktionen, die von vier heterologen Enzymen katalysiert werden. Darunter befindet sich eine gentechnisch veränderte SerC Mutante, eine Lactatdehydrogenase, eine 4-Hydroxybutyrat-CoA-transferase und eine Aldehyd/Alkoholdehydrogenase.