ISBN 9783868537772

978-3-86853-777-2, Reihe Biochemie

Lasse Reefschläger
Untersuchungen zu Kinasen und deren Interaktion mit Hsp90 und Cdc37

179 Seiten, Dissertation Technische Universität München (2010), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Ein Problem in der Src-Kinaseforschung besteht in der löslichen Expression der Src- Kinasen. Dies wurde durch Etablierung des Baculovirus-Expressionssystems gelöst. Zwar wurde auch eine lösliche Expression in E.coli erreicht, dies konnte jedoch nur mit einer Verunreinigung durch GroEL erreicht werden. Mit dem Baculovirus- Expressionssystem wurden in der vorliegenden Arbeit die c-Src und die v-Src-Kinase sowie verschiedene c-Src-Mutanten exprimiert.

c-Src und v-Src unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Stabilität enorm. Welche Mutationen jedoch zu diesen Unterschieden führen, ist nicht bekannt. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene Mutationen (R95W, D117N und R318Q) in c-Src eingefügt, die den entsprechenden Aminosäuren in v-Src entsprachen. Mit diesen Mutanten wurden Versuche zur Stabilität und Aktivität durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anschließend mit den Ergebnissen für c-Src und v-Src verglichen. So stellte sich heraus, dass drei aktivierende Mutationen die Stabilität der c-Src-Kinase nicht negativ beeinflussen. Auch eine Triple-Mutante (3M), bei der die drei Mutationen gleichzetig auftraten, zeigte zwar eine erhöhte Aktivität, nicht jedoch eine verringerte Stabilität. Erst durch die zusätzliche Deletion des C-Terminus inklusive des regulatorischen Tyrosin 527 (3M+∆C), verringerte sich die Stabilität von c-Src. Durch diese Deletion erhöht sich zusätzlich noch die Aktivität der Kinase. Viabilitätsassays in Hefen bestätigten diese Beobachtung. So führte nur die Expression der c- Src3M+∆C Mutante in Hefen zu einem Wachstumsdefekt, ähnlich wie bei v-Src. Nach Expression der anderen Mutanten in Hefen war die Viabilität nicht beeinträchtigt. Eine Hsp90-Abhängigkeit konnte mittels Macbecin nachgewiesen werden. Durch Einsatz dieses Hsp90-Inhibitors wurde die Toxizität von v-Src und c- Src3M+∆C unterdrückt.

c-Src und v-Src sind in vivo unterschiedlich stark von Hsp90 abhängig. Der Einfluss von Hsp90 und weiteren Chaperonen auf die Stabilität wurde in vitro in verschiedenen Versuchen untersucht. Bei steigenden Temperaturen verlor v-Src wesentlich schneller ihre Aktivität als c-Src. In Anwesenheit von Hsp90 alleine wurde die v-Src Kinase nur bei geringen Temperaturerhöhungen stabilisiert. Bei höheren Temperaturen geht dieser Effekt verloren. Auch eine Kombination aus Hsp90 und Cdc37 alleine konnte die Aktivität der Kinase bei höheren Temperaturen nicht stabilisieren. Hier spielen wohl weitere Chaperone und Co-Chaperone eine Rolle. Inaktiviertes v-Src konnte nämlich durch einen Chaperon-Mix aus Hsp90, Hsp70, Hsp40, Cdc37 und CKII zumindest teilweise reaktiviert werden. Bei c-Src dagegen wurde keine Reaktivierung festgestellt.