ISBN 9783868537840

978-3-86853-784-0, Reihe Analytische Chemie

Carolin Müller
Immunoanalytische Detektion von Beta2-Glykoprotein I-Autoantikörpern beim Antiphospholipid-Syndrom

149 Seiten, Dissertation Technische Universität München (2010), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Nachweisverfahren für aPL zur Labordiagnostik des APS, mittels SPR-Biosensor, ELISA und Mikroarray untersucht. Hierbei wurde zuerst der Einfluss von verschiedenen Präparationen des Hauptantigens β2-GPI auf die diagnostische Effizienz und die Vergleichbarkeit der verwendeten Testformate untersucht. Dazu wurden drei humane und zwei rekombinant hergestellte Proteine sowie ein bovines Protein ausgewählt. Um Informationen über Reinheit und Molekulargewicht zu erhalten, wurden die einzelnen Präparationen mittels Gelelektrophorese und Western Blot näher charakterisiert. Die dabei festgestellten Unregelmäßigkeiten waren auf eine Abweichung des Glykosylierungsmusters sowie Verunreinigungen zurückzuführen. Bei den im Anschluss durchgeführten ELISA-Messungen, zur Bestimmung von IgG- und IgM-Antikörper, waren alle erhaltenen AUCs signifikant größer als 0,5. Dies machte deutlich, dass alle untersuchten β2-GPI-Präparationen zwischen gesunden und an APS erkrankten Personen unterscheiden konnten. Verglich man hingegen die am besten, mit der am schlechtesten auftrennenden Präparation, wurden signifikante Unterschiede für die ermittelten AUC festgestellt. Interessant hierbei war v.a. die Tatsache, dass trotz der Verwendung der beiden Kalibratoren EY2C9 und HCAL, die Vergleichbarkeit der einzelnen ELISAs (IgG und gleichermaßen IgM) untereinander nicht zufriedenstellend war. Obwohl alle Präparationen gut zwischen beiden Studiengruppen unterscheiden konnten, beeinflussten sie die Bestimmung der individuellen anti-β2-GPI-Titer beträchtlich.

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden dann von β2-GPI-abgeleitete Antigenfragmente (Peptide) untersucht. Dabei wurde zuerst versucht mit diesen Peptiden zwischen APS-Patienten und gesunden Probanden unterscheiden zu können. Für eine kovalente und gerichtete Immobilisation der antigenen Strukturen auf einem SPR-Biosensorchip, wurden 3 der 8 Peptide erfolgreich rekombinant als SNAP-tag-Fusionsprotein exprimiert. Hierfür wird das SNAP-Substrat Benzylguanin an die Chipoberfläche gekoppelt. Die darin enthaltene Etherfunktion wird im Anschluss durch das Fusionsprotein gespalten und das Guanosin wird freigesetzt. Die daraus resultierende Bindung des Fusionsproteins konnte mittels anti-SNAP-tag-Antikörper nachgewiesen werden.

Der letzte Teil der Arbeit widmete sich dem Aufbau einer Mikroarray-Analysemethode zur parallelen Detektion mehrerer Autoantikörper in humanem Serum. In der Literatur werden neben den beiden Hauptantigenen beim APS (CL, β2-GPI) noch zahlreiche Andere diskutiert. Durch eine Mikroarray-Messung ist die Möglichkeit gegeben, einen einzigen Patienten auf viele verschiedene Antikörper zu testen und Aufschluss über alle bei der Krankheit involvierten Antikörper zu erhalten. Für die Etablierung der Methode wurden aber neben β2-GPI anfangs nur zwei weitere Antigene getestet: Prothrombin sowie Annexin V. Hauptaugenmerk wurde zuerst auf eine optimale Biokonjugations-Strategie der drei Proteine gelegt. Neben verschiedenen Beschichtungstechniken des Objektträgers wurden auch unterschiedliche Immobilisationspuffer getestet. Dabei stellte sich eine Beschichtung der Glasobjektträger mit DAPEG als am besten geeignete Oberfläche heraus, auf der mittels PBS als Immobilisationspuffer homogene Spots erhalten werden konnten. Weitere Optimierungsschritte sowie die Untersuchung eines größeren Patientenkollektivs müssen dennoch folgen.