ISBN 978-3-8439-0257-1

978-3-8439-0257-1, Reihe Biologie

Patricia Kurth
Funktionsanalysen des Repressor- bzw. Aktivatorkomplexes des Notch Signalwegs in Drosophila melanogaster

226 Seiten, Dissertation Universität Hohenheim Stuttgart-Hohenheim (2011), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Der Notch Signalweg ist ein, in der Evolution der Metazoen, hoch konservierter Signalmechanismus, der Zell-Zell-Kommunikation benachbarter Zellen erlaubt und somit deren Differenzierung ermöglicht.

Die Aktivierung des Notch Signalwegs hat die Spaltung des Notch Rezeptors zur Folge, worauf die freigesetzte intrazelluläre Domäne (ICN) mit dem DNA Bindeprotein Su(H) (das Drosophila melanogster Homolog des humanen CBF1) und dem Koaktivator Mastermind einen Aktivatorkomplex ausbildet. In Abwesenheit von ICN unterdrückt Su(H) die Aktivierung der Notch Zielgene über die Ausbildung eines Repressorkomplexes, der in Drosophila durch die Bindung des generellen Notch Antagonisten Hairless und zwei allgemeine Korepressoren aufgebaut wird.

Die Kristallstruktur des Aktivatorkomplexes ist bekannt. Sie belegt die sehr hohe Ähnlichkeit der Notch Aktivatorkomponenten innerhalb der Metazoen. Dagegen scheint der Repressorkomplex in verschiedenen Organismen sehr unterschiedlich. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Notch Repressorkomplexes in Drosophila und der Wechsel von Aktivator- zu Repressorkomplex.

Im ersten Ansatz erfolgte die exakte Eingrenzung des für die Hairless Interaktion relevanten Bereichs in Su(H) über Bindungsstudien mit verschiedenen Su(H) Deletionskonstrukten. Dieser konnte auf den N-terminalen Bereich sowie die CTD Domäne des Proteins festgelegt werden. Im Gegensatz dazu interagieren die Korepressoren im Säuger vornehmlich mit der BTD Domäne von CBF1. Um die spezifischen Kontaktstellen zwischen Su(H) und Hairless zu identifizieren, wurden unter Zuhilfenahme der Kristallstruktur des Aktivatorkomplexes verschiedene Aminosäuresubstitutionen in Su(H) eingeführt. Auswirkungen der ausgetauschten Aminosäuren auf die Su(H)/Hairless Interaktion wurden zunächst im Hefe-Zwei- Hybrid System analysiert, um im weiteren Verlauf über Zellkulturversuche und in vivo Studien in der Fliege bestätigt zu werden. Anschließend wurden die unterschiedlichen Su(H) Proteinvarianten auf ihre Bindungsaffinität zu ICN und Mastermind untersucht, um Störungen der Aktivatorkomplexbildung ausschließen zu können. Band Shift Analysen zeigten ein unverändertes DNA-Bindeverhalten der Su(H) Varianten. Es konnten zwei Aminosäuren in Su(H) identifiziert werden, Tryptophan 491 und Arginin 493, die an der Interaktion mit Hairless beteiligt sind. Da ihre Substitution die Bindung zu Hairless zwar abschwächt aber nicht eliminiert, sind wahrscheinlich zusätzliche, bisher noch nicht identifizierte Bindungsstellen in Su(H) vorhanden.