ISBN 978-3-8439-1078-1

978-3-8439-1078-1, Reihe Pharmazeutische Chemie

Maria Polley
Entwicklung von Bindungsassays für den murinen GABA-Transporter Subtyp 4

227 Seiten, Dissertation Ludwig-Maximilians-Universität München (2013), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Die GABA-Transportproteine (GATs) sind essentielle Bestandteile im Regulationsmechanismus der GABAergen Neurotransmission. Vier verschiedene GAT-Suptypen sind von der Maus beschrieben und kloniert worden, mGAT1, mGAT2, mGAT3 und mGAT4. Neben mGAT1 stellt insbesondere mGAT4 ein interessantes pharmakologisches Target dar. Bisher wurden dafür aber weder radioaktiv- oder fluoreszenzgelabelte Liganden entwickelt, noch die entsprechenden Bindungsassays etabliert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein Bindungsassay für den GABA-Transporter mGAT4 entwickelt werden, bei dem ein so genannter nativer, d.h. labelfreier, Marker eingesetzt wird, dessen Bindung am Target mittels Massenspektrometrie bestimmt wird. Das Messprinzip der MS-Bindungsstudien bietet im Vergleich zu Radioligandbindungsstudien Vorteile, da dabei auf den Einsatz eines Radioliganden verzichtet werden kann.

Ziel des Verfahrens war es, einen Assay zu entwickeln, der wie MS-Bindungsassays allgemein dem Prinzip der Radioligandbindungsstudien folgt. Bei ihm wurde der Marker mit dem Target mGAT4 inkubiert und der gebildete Target-Ligand-Komplex durch schnelle Vakuumfiltration von freiem Marker getrennt. Anschließend wurde der gebundene Marker aus dem Komplex frei gesetzt, bevor er massenspektrometrisch quantifiziert wurde.

Zunächst wurde ein zum Target mGAT4 ausreichend affiner und selektiver Ligand als Marker ausgesucht. Des Weiteren wurde ein mehrfach deuteriertes Analogon des Markers synthetisiert, welcher als interner Standard für die MS-Quantifizierung verwendet wurde, um potentielle Matrixeffekte zu kompensieren. Für die Quantifizierung des Markers wurde eine LC-MS/MS-Methode entwickelt, die einen hohen Probendurchsatz ermöglicht und zugleich spezifisch für den Marker ist. Nach erfolgreicher Entwicklung wurde die LC-ESI-MS/MS-Methode nach den Richtlinien der U.S. FDA, die für die Validierung bioanalytischer Methoden gelten, validiert, um deren Eignung für den Einsatz in Bindungsassays zu verifizieren.

Des Weiteren wurde das Target mGAT4 über Radioligandbindungsstudien charakterisiert.