ISBN 978-3-8439-1980-7

978-3-8439-1980-7, Reihe Organische Chemie

Christoph Kröner
Entwicklung eines triplexbasierten Speichers für Purine

115 Seiten, Dissertation Universität Stuttgart (2014), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Viele funktionale Moleküle in der Zelle enthalten eine Purineinheit als Erkennungsstruktur. Intrazelluläre Energieträger wie ATP und GTP, aber auch die reduzierten, energiereichen Cofaktoren NADH und FADH2 sind zentral für den Metabolismus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden DNA-Triplexe entworfen und untersucht, die eine Bindungstasche im zentralen Oligopurin-Strang enthalten und deshalb mit Purinen beladen werden können. Die anschließende Freisetzung von purinhaltigen Cofaktoren konnte zur Steuerung von Biolumineszenz genutzt werden, die durch das Enzym Luciferase katalysiert wird.

Um Speicher aufzubauen, wurde zunächst ein intramolekulares Strangsystem entworfen, um ein reversibles Be- und Entladen mit Liganden ohne Verluste von Strängen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von "poly-T-Loops" gelang der Entwurf eines solchen Motivs, welches unter anderem die Cofaktoren FAD und NADH mit niedrig micromolaren Dissoziationskonstanten bindet. Eine Sequenzmodulation eines zur Tasche benachbarten Basen-tripletts führte zur signifikant höheren Selektivität für die Bindung von FAD gegenüber ATP.

Um makroskopische Systeme zur Speicherung von Biofunktionsmolekülen zu erhalten, wurden Feststoff-Systeme getestet. Eine Freisetzung von cAMP aus einem auf einer Glasoberfläche immobilisiertem Bindungsmotiv resultierte in einer vermehrten Bewegung von Dictyostelium Zellen, die vermutlich auf Chemotaxis beruht, wie die Experimente eines Kooperationspartners zeigten. Zudem gelang die Immobilisierung eines Bindungsmotivs auf Sepharose-Partikeln. Durch dieses immobilisierte Motiv konnte bei ca. 4 °C der Cofaktor NADH komplexiert und durch leichtes Erwärmen freigesetzt werden. In Gegenwart von Luciferase, sowie entsprechender Reagenzien verursachte freigesetztes NADH eine visuell verfolgbare Biolumineszenz.

In einem letzten Projekt wurde ein Bindungsmotiv entworfen, das sich intrazellulär exprimieren lässt. Dazu wurde die Bindungstasche mit einem "T10-Loop" überbrückt, so dass keine Termini mehr Teil dieser waren. Das resultierende DNA-Motiv band den "second-messenger" cGMP mit einem Kd von 0.4 µM. Ein kodierender Genabschnitt zu einem aus dieser Sequenz abgeleiteten RNA-Bindungsmotiv wurde von einem Kooperationspartner zu einem Vektor kloniert. Ein Exprimieren des RNA-Motivs in murinen Zellen führte in Experimenten des Kooperationspartners erstmalig zu einer verringerten cGMP-Antwort auf eine Stimulierung mit NO.