ISBN 978-3-8439-2944-8

978-3-8439-2944-8, Reihe Organische Chemie

Sven Vollmer
Cofaktor-bindende DNA-Triplexmotive mit hoher Speicherdichte

152 Seiten, Dissertation Universität Stuttgart (2016), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation sollten effiziente DNA-Triplexbindungsmotive zum Binden von Cofaktoren entwickelt werden, die eine erhöhte Speicherdichte aufweisen. Hierfür wurde ein DNA-Triplexmotiv zum Binden von Liganden, die Adenin in ihrer Struktur enthalten entworfen, das aus lediglich 38 Nukleotiden aufgebaut war. Um dieses zu stabilisieren wurden die Pyrimidinstränge über eine Perylendiimid-Brücke verknüpft. Synthetisiert wurde der Pyrimidinstrang über DNA-Festphasensynthese, wobei neben den konventionellen Reagenzien auch das zuvor synthetisierte Perylendiimidphosphitamid mit eingesetzt wurde. Es wurde die thermische Stabilität des so entworfenen Triplexmotivs über UV-Schmelzkurven und das Bindungsverhalten gegenüber den Liganden SAM und cAMP mit membranbasierten Filtrationsassays untersucht. Um die Speicherdichte weiter zu erhöhen wurden DNA-Triplexe zum Binden von mehr als einem Ligandmolekül entworfen. Die Herausforderung war hierbei die Insertion von mehreren Bindungsstellen unter gleichzeitigem Erhalt der vorhersagbaren, kanonischen Struktur. In dieser Arbeit wurde systematisch die Anzahl der Bindungsstellen von 3 auf 6 sowie deren Größe und deren Abstand zueinander in triplexbasierten Bindungsmotiven variiert. Um derartige Motive zu stabilisieren wurden die einzelnen Bindungsstellen durch den Einbau von Hexaethylenglykol-, 1,2-Dideoxyribose- oder 1,3-Propandiol-Brücken kovalent verknüpft. Die thermische Stabilität der über DNA-Festphasensynthese hergestellten Triplexmotive wurde ebenfalls über UV-Schmelzkurvenexperimente untersucht. Es konnte ein DNA-Triplexmotiv synthetisiert werden, dass aus 60 Nukleotiden aufgebaut war, vier Bindungsstellen aufwies und in der Lage war die Liganden cAMP, FAD und ATP mit scheinbaren Dissoziationskonstanten im niedrig micromolaren Bereich, hochaffin zu binden.

Abschließend wurden durch die Immobilisierung eines Triplexmotivs auf Sepharose, Speichersysteme entwickelt. Die Bindung von ATP an das immobilisierte Bindungsmotiv bei 4 °C und die anschließende Freisetzung bei 40 °C konnte durch Kopplung an ein Luciferase-Assay nachgewiesen werden. Nach Freisetzung des Liganden konnte das Eintreten der Biolumineszenz bereits mit bloßem Auge beobachtet werden