ISBN 9783843918633

978-3-8439-1863-3, Reihe Lebensmittelchemie

Franziska Vaagt
Innovative molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik

190 Seiten, Dissertation Universität Hamburg (2014), Softcover, A5

Zusammenfassung / Abstract

Das Ziel der Arbeit war es moderne DNA-analytische Methoden auf Fragestellungen im Bereich der Lebensmittelanalytik anzuwenden. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob sich isothermale Methoden für eine Anwendung vor Ort, ohne aufwendige Laboreinrichtungen, eignen. Als Modell wurden die Methoden hauptsächlich zur Differenzierung von Pilzen eingesetzt, da diese Lebensmittelgruppe eine große Vielfalt von Fragestellungen bietet.

Der Schwerpunkt lag auf der Loop Mediated Isothermal Amplification- (LAMP) Methode. Die Herausforderungen bei der Entwicklung einer Vor-Ort-Analytik waren insbesondere die DNA-Isolierung, die Amplifikation sowie die visuelle Detektion mit einem Minimum an apparativem Aufwand und in kürzester Zeit durchzuführen. Es wurden zwei Methoden zur DNA-Isolierung entwickelt, die beide auf der reversiblen Bindung der DNA an eine Silika-Oberfläche beruhen. In beiden Fällen war es möglich, amplifizierbare DNA für eine anschließende Analytik aus unterschiedlichen Matrices (z. B. rohe/gebratene Pilze, Pilzgerichte und Fische) zu erhalten. Zur qualitativen Analytik konnten Nachweise, mit Hilfe von LAMP-Methoden, für insgesamt acht Pilze erarbeitet werden, z. B. für den Grünen Knollenblätterpilz. Die visuelle Detektion erfolgte direkt durch einen Farbumschlag mit Hilfe von SYBR® Green I oder durch einen Teststreifen (engl.: lateral flow dipstick, LFD), auf denen sich farbige Banden bilden.

Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte LAMP-LFD/SYBR®-Green I - Methode eine schnelle (unter 2h inklusive DNA-Isolierung), spezifische und zuverlässige Detektion von Giftpilzen auch in Mischungen ermöglicht.

Desweiteren wurden PCR-Amplifikationsprodukte mittels Denaturierender-HPLC (DHPLC) analysiert. Mit Hilfe der DHPLC konnten Methoden entwickelt werden, die eine Unterscheidung von PCR-Amplifikaten verschiedener Pilze, unter Verwendung von nur einem unspezifischen Primerpaar, ermöglichen. An ausgewählten Beispielen konnte gezeigt werden, dass eine Differenzierung von geringen Längenunterschieden in den Amplifikationsprodukten möglich war. Mit dieser Methode konnten Pilze im rohen, gebratenen Zustand sowie nach einer simulierten Verdauung und Pilzgerichte/Pilzmischungen analysiert werden. Durch die Verwendung des denaturierenden Modus konnten Amplifikate mit einem Einzelbasenpaaraustausch voneinander unterschieden werden.

Die beschriebenen Methoden eignen sich somit für eine Authentizitäts- und Qualitätskontrolle im Lebensmittelbereich.